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Sep 30, 2023

ポリプロリン II 型ヘリカル不凍液タンパク質はトビムシに広く分布しており、4 億年以上前のオルドビス紀に起源した可能性があります。

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8880 (2023) この記事を引用

185 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

不凍タンパク質（AFP）は氷の結晶に結合して生物の凍結を防ぎます。 魚や昆虫では、αヘリックス、球状タンパク質、いくつかの異なるβソレノイドなど、多様なAFPフォールドが見つかっています。 しかし、トビムシのような飛べない節足動物の AFP の種類はまだ十分に評価されていません。 ここで、寒帯または温帯に生息するトビムシ属 22 種のうち 18 種に不凍活性が存在することが示されました。 これらの AFP を特徴付けるために、氷アフィニティー精製による単離、MALDI 質量分析、アミノ酸組成分析、タンデム質量分析シークエンシング、トランスクリプトームシークエンシング、配列データベースのバイオインフォマティクス調査など、いくつかの方法が使用されました。 これらの AFP はすべてグリシン含有量が高く、トビムシに特有の同じポリプロリン II 型らせん束の折り目を持つと予測されました。 これらの六脚類は、約 4 億年前のアンデス - サハラ氷河期に、AFP を生成することが知られている 2 つの注文が分岐したオルドビス紀に発生しました。 したがって、約3,000万年前に始まる新生代氷河期に独立して発生した魚類のAFPとは異なり、AFPは当時発生し、その後の2つの氷河期とその間の温暖期を通じて多くの系統で存続した可能性があります。

氷点下の環境に住む生物は、凍結による細胞損傷を避けるために適応しなければなりません。 生体組織内で氷の結晶が形成されると、細胞の脱水や細胞膜の破壊が起こり、死に至る危険性があります1。 氷点下の温度を経験するニッチを占める生物は、氷の結晶に付着してその成長を防ぐことによって機能する不凍タンパク質 (AFP) を生成することがよくあります2。 結合すると、氷の成長は AFP の周囲の領域に限定され、氷の表面に微小な曲率が形成されます 3,4。 これにより、水が氷の格子に結合することがエネルギー的に好ましくなくなり、その結果、凝固温度が融解温度未満に低下します。これは熱ヒステリシス (TH) と呼ばれ、AFP の効力を定量化するために使用されます。

特徴付けられた最初の AFP は硬骨魚由来のものでした 5。 それ以来、AFP は他の魚類 6、昆虫 7、8、微生物 9、10、11 で観察されています。 魚類では、AFP は、約 2 億年ぶりに極に海氷が存在した 2,000 ～ 4,000 万年前に始まる新生代に発生したと考えられています 12,13。 海水では、高濃度の NaCl (約 0.45 M) により、海水の凝固温度が約 - 1.9 °C まで下がります。 魚の血液は溶質濃度が低く、約 - 0.8 °C で凍結するため、氷の結晶と接触すると凍結の核が発生し、魚が死ぬ可能性があります5。 したがって、魚類の AFP は、体の凍結温度を少なくとも 1.1 °C 下げるのに十分な量で、十分な活性を持って生産されなければなりません。 これは、AFPを持たない魚が凍死する危険がある氷の多い海でも安全に餌を探すことができるため、これらの魚に選択的利点をもたらします。 魚類ではこれまでに 4 種類の AFP が見つかっています: (1) アラニンに富む I 型 AFP、(2) レクチン様 II 型 AFP、(3) シアル酸合成酵素由来の III 型 AFP、(4) 不凍糖タンパク質 ( AFGP）。 異なる折り畳みがすべて同じ機能を実行するため、これらの AFP が最初にどのように発生したのかという疑問が生じます 14。

アラニンが豊富なαヘリックス I 型 AFP は、少なくとも 4 回独立して進化しました 15。 単純な反復性 AFGP は、重複と分岐によるトリプシノーゲン遺伝子からの 1 回を含む 2 回の独立した機会に発生しました 16。 II 型 AFP は C 型レクチン前駆体から進化し、側方遺伝子伝達によって少なくとも 2 つの遠く離れた魚類の分類枝に伝播しました 17,18。 シアル酸合成酵素遺伝子の重複と分岐により、III 型 AFP 遺伝子ファミリーが生じましたが、これは魚類の 1 系統でのみ発見されています 19。 これらの魚類の AFP 褶曲は、極氷河期に反応して過去数千万年以内に生じたと考えられています20。 昆虫 21,22 や微生物 23,24 などの生物の他の分野では、同じ役割を果たすために異なる AFP フォールドが独立して発生した例もあります。

トビムシは陸生節足動物の中で最も豊富で、すべての大陸で見られます25。 これらの小さな生物（通常、体長はわずか数ミリメートル）は通常、土に生息しますが、樹木、池、石の周りの湿った表面、または氷河に生息する種もあります。 トビムシの名前は、浸透圧とイオンの調節に関与する腹部臓器であるコロフォアに由来しています26。 腹部の 2 番目の特徴的な解剖学的特徴は、フルカとして知られるバネ仕掛けの器官で、これにより「ジャンプ」して捕食者から逃れることができます。 これにより、彼らに「トビムシ」というニックネームが付けられました。 これらの原始的な生物は約 4 億 5,000 万年前に誕生し、現在までに 10,000 種近くが分類されています27。 氷点下環境に生息する動物は、これらの過酷な条件で生き残るための耐寒メカニズムを備えており、その 1 つが AFP の生成です。 これまでにトビムシの数種が TH 活性 28,29,30,31 と耐寒性と過冷却能力 32 を持っていることが判明していましたが、現在までトビムシに存在する AFP の種類とその分布に関する体系的な研究は行われていませんでした。

最初に特徴付けられたトビムシ AFP は、Hypogastrura harveyi 由来の小さな 6.5 kDa アイソフォーム (HhAFP) でした 29。 HhAFP は、グリシンに富んだポリプロリン II 型 (PPII) らせんバンドルフォールド 33 構造を持つと予測されており、この構造は後に X 線結晶構造解析によって確認されました 34,35。 この折り畳みはトビムシに特有であると思われ、ループ領域によって接続された 2 層の逆平行 PPII ヘリックスで構成されています。 ヘリックスの周りの各回転は、G-X1-X2 のトリペプチド反復を伴う長さが正確に 3 残基であり、X1 は多くの場合グリシンです。 タンパク質のコアには内側を向いたグリシン残基が含まれており、側鎖がないため緊密なパッキングが可能です 33。 ヘリックスがコンパクトにパッキングされると、ヘリックス主鎖間に水素結合ネットワークが発達し、フォールドの安定性が高まります 36。 2 つの層は両方とも外側に尖った面を持っています。 1 つの表面は平坦で、小さな疎水性残基が含まれており、氷結合表面 (IBS) として機能すると考えられています 37。 この表面はアラニンが豊富ですが、セリン、スレオニン、バリン残基も含まれています。 反対側の表面は凹凸があり、より大きな残留物が含まれており、その一部は極性または帯電しています。 H. harveyi は、13 個のポリプロリン ヘリックスを持つと提案されている、より大きな 15.6 kDa AFP アイソフォームも生成します 38。

HhAFP の推定相同体は、アイスランドで収集された Megaphorura arctica (MaAFP) から最近特徴付けられました 31。 6.5 kDa MaAFP は、コード配列において HhAFP と高い類似性を共有していますが、それらの非翻訳領域 (UTR) は、共通の祖先を明確に確立できない程度に多様です。 さらに、Granisotoma Rainieri 由来の 9.6 kDa AFP アイソフォーム (GrAFP) も研究されました 39。 GrAFP の構造は、9 本のヘリックスを持つポリプロリン II 型束としてモデル化され、X 線結晶構造解析を使用して確認されました。 5 つの GrAFP cDNA の UTR を比較したところ、最も類似していないものは 69% の配列同一性しか共有していませんでした。 したがって、異なる種の UTR 間に類似性が欠けていても、相同性は反証されません。

今回我々は、4つの異なる大陸から収集された、現存するトビムシ目4つのうち2つ内の多数の科のトビムシ18種からのAFPを特徴付けた。 分析の範囲は、利用可能なバイオマスの量によって決まりました。 少量のトビムシ (凍結乾燥組織 100 mg 未満) を使用して、TH 活性と氷の形状を測定しました。 AFP は、氷親和性精製 (IAP) によって大きなサンプル (凍結乾燥組織 100 mg 以上) から精製され、MALDI-MS、アミノ酸組成、および/またはタンデム質量分析によって特性評価されました。 トランスクリプトームは、核酸レベルで AFP 配列を推定するために、また場合によってはコードされたタンパク質を組換えによって発現させるために、いくつかの種から生成されました。 ここで試験したさまざまなトビムシに存在する AFP はすべて、基底面での氷の成長を阻害し、それらが過剰に活動している可能性があることを示唆しています。 より詳細な分析が可能な場合、調べたすべての AFP は、PPII ヘリックス束を示す同じグリシンに富むトリペプチドの繰り返しパターンを持っていました。 現在まで、このひだはトビバタビでのみ発見されており、遠方の種にまたがって存在することは、PPII らせん束ひだの起源が、このグループが発生した直後の基底トビバナ種に由来することを示唆しています。

ここでは、5 つの科を代表する 20 の新種が TH についてテストされました (補足表 1)。 ほとんどの種は著者らによって野外で収集されましたが、いくつかの種は他の研究室の培養物から提供されました。 トビムシは通常、木炭と混ぜた湿った焼き石膏を入れたペトリ皿で数年間維持され、乾燥パン酵母および/または緑藻を自由に与えられました。 すべての種を 20 °C で 12 時間明所、12 時間暗所で保管しました。 この手順の例外は、野外で収集され、実験室で低温順応された M. arctica と Enomobrya nivalis (補足表 1)、および野外で収集された後すぐに冷凍された Cryptopygus antarcticus でした。 22 種の研究グループを完了した H. harveyi29 および G. Rainieri39 は、前述のように収集されました。

AFP 合成を誘導するために、標本を暗闇と低温の 10 °C で 19 日間、続いて 5 °C で 13 日間、そして 1.5 °C で 28 日間順応させました。 次いで、動物を２日間凍結乾燥した。 乾燥させた動物を緩衝液（50 mM Tris-HCl（pH 7.8）、150 mM NaCl、1 mM フェニルチオカルバミドおよび 1 × EDTA フリー Roche プロテアーゼ阻害剤カクテル）に 1:8（w/v 比）で加え、 1.5 mL 微量遠心管に入った使い捨てプラスチック乳棒。 AFP の熱変性を防ぐために、すべての操作とサンプルの一時保管は氷上または 4 °C で行われました。 ホモジネートを16,300×g、4℃で30分間遠心分離しました。 脂質層の下の水性画分をTH測定のために除去した。

タンパク質特性評価のための AFP 抽出は、100 mg を超える凍結乾燥動物を使用して実行されました。 IKA ULTRA-TURRAX 分散機 (Staufen、ドイツ) を使用して、組織サンプルを緩衝液 (50 mM Tris-HCl (pH 7.8)、150 mM NaCl、1 mM フェニルチオカルバミドおよび 1 × EDTA フリー Roche プロテアーゼ阻害剤カクテル) 中でホモジナイズしました。 ホモジネートを２２，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清をグラスウールで濾過して脂質を除去した。 濾過した上清中の AFP は、前述のように 40 回の氷殻精製を使用して回収されました。 各調製物の最終氷画分を、Sorvall ST16R 遠心分離機で 3000 xg で遠心した AmiconUltracel 3 K フィルター (MilliporeSigma、バーリントン、マサチューセッツ州、米国) を使用して < 500 μL に濃縮しました。

アミノ酸組成は、SickKids Proteomics, Analytics, Robotics & Chemical Biology Center (SPARC、The Hospital for Sick Children, Toronto, ON, Canada) で前述のように酸加水分解によって決定され 40、タンパク質濃度の計算にも使用されました。

MALDI-TOF MS は、Protein Function Discovery Facility (カナダ、オンタリオ州キングストンのクイーンズ大学) で、SCIEX Voyager DE Pro を使用し、リニア モードで乾燥液滴上の α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸マトリックスを使用して実行されました。 タンデム質量分析法によるタンパク質の配列決定は、SickKids プロテオミクス、分析、ロボット工学およびケミカル バイオロジー センター (SPARC、カナダ、オンタリオ州トロントの病児病院) で行われました。

RNA サンプルは、RNAlater (Thermo Fisher、Waltham、MA、USA) に保存された 30 ～ 50 mg の組織から抽出されました。 抽出は前述のように実行されました 39。 C. antarcticus のトランスクリプトームは配列決定およびジェノタイピング センター (米国デラウェア州ニューアーク、デラウェア大学) で集められ、G. ライニエリと E. ニバリスのトランスクリプトームはゲノム科学研究所 (メリーランド大学ボルチモア) で集められました。 、メリーランド州、米国）。

AFP を含むサンプルは、ペルチェ ユニット上の液浸油で満たされたグリッドに注入されました。 温度は、ナノリットル浸透圧計（Micro-Ice Ltd、イスラエル、アロンシュブット）およびモデル 3040 温度コントローラー（米国、カリフォルニア州アーバイン、ニューポート）を使用して制御しました。 サンプルを急速冷凍し、単一の氷の結晶が残るまでゆっくりと溶かしました。 温度は融点直下に保たれ、氷の成長が始まるまで 0.075 °C/分の速度で低下しました。 TH 測定中の氷の結晶のビデオは、Panasonic WV-BL200 CCTV カメラまたは DMK 33UX249 USB 3.0 モノクロ産業用カメラ (The Imaging Source、米国ノースカロライナ州シャーロット) を使用して記録されました。

G. ライニエリ (QQY00623.1) およびフォルソミア カンジダ (OXA44825.1) AFP のコドン最適化合成遺伝子は、GeneArt (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) に注文しました。 シグナルペプチドをコードする DNA が除去され、NdeI 切断部位の導入を助けるために N 末端メチオニン残基がコードされました。 C末端にはロイシンとグルタミン酸コドンを導入し、XhoI切断部位を付加した。 遺伝子は pET-24a ベクターにサブクローニングされました 39。 得られたプラスミドを TOP10 コンピテントセル (Invitrogen、米国カリフォルニア州カールスバッド) に形質転換し、GeneJET Plasmid Miniprep キット (Thermo Fisher、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を使用して単離しました。 プラスミドを BL21 (DE3) 発現細胞 (Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州、米国) に再形質転換する前に、DNA の配列をチェックしました。 細胞培養物は、100 μg/mL カナマイシンを含む溶原性ブロス培地中で 37 °C で増殖させました。 OD600 が 0.6 ～ 0.8 に達したら、細胞培養物を 20 °C に冷却し、1 mM イソプロピル β-d-1-チオガラクトピラノシドを添加して一晩細胞培養を誘導しました。 細胞を4500×gで30分間遠心分離し、50 mLの溶解バッファー（20 mM Tris/HCl (pH 7.8)、500 mM NaCl、5 mM イミダゾール、0.1 mM フッ化フェニルメチルスルホニル、およびcOmplete™ Ultraの溶解錠剤1錠）に再懸濁しました。プロテアーゼ阻害剤カクテル)。 タンパク質の変性を防ぐために、細胞を 10 秒間で 16 回超音波処理し、サイクル間で 4 °C に冷却しました。

Ni アフィニティークロマトグラフィーを使用して、His タグ付き組換え AFP を溶解物上清から分離しました。 AFP を含む画分をプールし、氷殻を播種した 250 mL 丸底フラスコにロードし、氷親和性精製しました 39。

各種の分類 ID は NCBI 分類データベースから抽出されました。 系統樹は、phyloT (https://phylot.biobyte.de/) を使用して構築されました。

22 種類のトビムシ属の異なる種からのホモジネート上清全体の TH 活性と氷結晶の形成を評価しました (図 1)。 テストした 22 種のうち 18 種に TH 活性がありました。 活性ホモジネートで観察された単一の氷の結晶は、c 軸の周りに対称な規定の楕円形に溶けました。これは、AFP が基底面を含むいくつかの氷面に結合して安定化していることを示唆しています。 対照的に、基底面に結合しないAFP、つまりタイプI AFPの存在下で形成された結晶は、冷却されるにつれて溶けて円盤になり、六角両錐に成長します（図1、左上のパネル）。 トビモランのサンプルで凝固点を超えると、樹枝状の氷の成長が a 軸から発生し、TH 活性が高いサンプルで急速に成長しました。 Hypogastrura viatica と M. arctica では、樹状突起のバーストが 1 フレーム (1/12 秒) 以内に視野をカバーしました。 対照的に、バッファーコントロール内の氷の結晶は円盤状であり、同じ形状で成長し続けましたが、I型AFPによる破裂はc軸に沿って発生しました（図1右上のパネル）。 サンプルは同じ w/v 比で均質化されており、相対的な TH 活性の比較が可能であり、異なる種の活性は 0.2 ～ 1.7 °C の範囲でした。 これらの違いは、遺伝子のコピー数、発現レベル、および/または AFP の活性の変動から生じる可能性があります。

トビバホモジネートにおける氷の成形の比較。 凍結乾燥したトビムシを緩衝液 (8:1 v/w) 中で穏やかにホモジナイズし、上清の不凍活性 (TH) をアッセイしました。 それぞれの種 (左の列) について、TH 測定中 (中列) と凝固点を超えた瞬間 (右の列) の画像がビデオからキャプチャされました。 陽性対照は、冬ヒラメ (Pseudopleuronectes americanus) からの I 型 AFP です。 ネガティブコントロールは緩衝液（50 mM Tris-HCl（pH 7.8）、150 mM NaCl、1 mM フェニルチオカルバミドおよび 1 × EDTA フリー Roche プロテアーゼ阻害剤カクテル）です。

大きな H. harveyi AFP アイソフォームの蛍光氷面分析では、氷の基底面とプリズム面の両方への結合が示されました 38。 結晶学的水は氷の基底面と主プリズム面の両方に整列する可能性があるため、基底面結合の裏付けは GrAFP の X 線結晶構造によっても提供されました 39。 さらに、ホモジネートのうち 2 つの高い活性 (> 2 °C) は、Tenebrio molitor41 などの他の節足動物と同様、ほとんどのトビムシが高活性 AFP を生産することを示唆しています。 さらに、トビタビ AFP と冬ヒラメの I 型 AFP との間の氷の形成と破裂における一貫した違い (図 1) は、トビタビ AFP による基底面結合によるものと考えられます。

3 種のトビムシ (H. harveyi、G. Rainieri、および M. arctica) から抽出された AFP のアミノ酸組成は、これまでに報告されています 29、31、39。 ここでは、追加の 3 種 (Cryptopygus antarcticus、Folsomia candida、および Protaphorura pseudovanderdrifti) からの AFP 抽出物もアミノ酸分析の対象となりました (補足表 2)。 いずれもグリシンとアラニンを豊富に含んでおり、これらはPPIIらせん束の折り畳みの特徴となります。 しかし、これらのグリシンとアラニンの割合は、さらに精製された H. harveyi よりも低く、微量の他のタンパク質による何らかの汚染が示唆されました。 IAP の各ラウンドでは非 AFP タンパク質レベルが約 10 分の 1 しか減少しないため、これは予想されることです 40。 それにもかかわらず、MALDI-MS は、AFP が IAP の後に優勢な種であることを示唆しました (図 2)。 P. pseudovanderdrifti (図 2A)、C. antarcticus (図 2B)、および Ceratophysella denticulata (図 2C) の抽出物はすべて、2 つ以上の小さなアイソフォーム (5.9 ～ 8.8 kDa) および 1 つまたはM. arctica (図 2D) 31 および H. harveyi (6.5 および 15.7 kDa) 29 について以前に報告されたものと同様、より大きなアイソフォーム (15.5 ～ 17.5 kDa)。 対照的に、F. カンジダには、約 16 Da 異なる 4 つのサブピークからなるメイン ピークが 1 つあり (図 2E)、G. ライニエリ (図 2F)39 には、6.9 ～ 12.2 の狭い範囲内にアイソフォームのクラスターが 3 つあります。 kDa。 ショルダーピークによって示されるように、アイソフォームにも小さな変動があるようです。 G. ライニエリ 39 の 5 つの 9.6 kDa アイソフォームと同様に、各集団内にはいくつかのアミノ酸多型を持つアイソフォームが存在すると考えられます。

精製トビラ AFP 抽出物の MALDI スペクトル。 (A) Protaphorura pseudovanderdrifti、(B) Cryptopygus antarcticus、(C) Ceratophysella denticulata、(D) Megaphorura arctica、(E) Folsomia candida、および (F) Granisotoma Rainieri からのタンパク質を 4 回の氷親和性精製で精製し、 MALDI-MSの対象。 主要なピーク質量にはラベルが付けられています。

トリプシン断片のタンデム質量分析による精製 AFP の部分配列決定により、単離されたタンパク質とその核酸配列の間に強固なつながりが得られます。 これは以前、トランスクリプトームデータから完全長の M. arctica および G. Rainieri の AFP 配列を推定するのに役立ちました 31,39。 この研究では、C. antarcticus および F. candida AFP のトリプシン断片にもグリシンとアラニンが豊富に含まれており、GXX リピート モチーフが含まれていました (表 1)。

NCBI データベースには、2 つの研究 42,43 からの 3,400 を超える C. antarcticus EST が存在します。 BLAST検索により、全長コード配列を持つ2つ（GR869204.1およびFF279148.1）と、不完全なコード配列を持つ2つ（GR870234.1およびFF278983.1）が同定されました。 全長転写物は、19アミノ酸のシグナルペプチドを除去した後、108アミノ酸のタンパク質（8.5kDa）をコードしていた（図3A）。 GR870234.1 は N 末端メチオニン開始コドンを欠いており、FF278983.1 は残基 86 で切断された C 末端を持っていました。同様の質量を持つピークが MALDI プロファイルで見られました (図 2B)。 この研究で生成されたトランスクリプトーム内で追加のアイソフォームが同定されました。 8.5 kDa アイソフォームをコードする 3 つ (OQ445583、OQ445586、および OQ445587)、および 15 kDa アイソフォームをコードする 8 つ (OQ445584、OQ445585、OQ445588、OQ445589、OQ445590、OQ445591、OQ445592) 、OQ445593）。 8.5 kDa アイソフォームは、ヌクレオチドおよびタンパク質レベルで 91 ～ 93% の配列同一性を持っていました (図 3A)。 模式図を使用して各ヘリックスを視覚化すると、8.5 kDa アイソフォームは 6 つのヘリックスを持つようにモデル化できます (図 3B)。 3 ～ 4 個の GX1X2 リピート モチーフの文字列は、長さ 3 ～ 6 アミノ酸残基の可変ループ領域によって分離された個々のヘリックスに分離できます。 1 つのヘリックスと次のヘリックスの X2 残基は疎水性残基と親水性残基を交互に配置しており、これにより特徴的な氷結合部位 (図 3 の青色の表面) と非氷結合部位 (図 3 の赤色の表面) が生成されます。 15 kDa アイソフォームは 3 つのグループに分類されました。 最初のグループは、20 アミノ酸のシグナルペプチドと 192 アミノ酸の成熟タンパク質を持つ 3 つのアイソフォームを持っていました (図 4A)。 CaAFPb-4 には 4 つのアミノ酸が欠失しており、成熟タンパク質の長さは 188 アミノ酸になっています。 2 番目のグループは、19 アミノ酸のシグナルペプチドと 192 アミノ酸の成熟タンパク質を持つ 3 つのアイソフォームを持っていました (図 4B)。 3 番目のタイプは、19 アミノ酸のシグナルペプチドと 187 アミノ酸の成熟タンパク質を持つ単一のアイソフォーム (CaAFPb-8) を持っていました (図 4C)。 最初と 2 番目のグループ内では、アイソフォームはそれぞれ 88 ～ 99% と 98 ～ 99% の配列同一性を示しましたが、これらのグループと 3 番目のアイソフォーム タイプの間では、配列同一性は 50 ～ 52% のみでした。 各グループ内では、ループ領域および非 IBS 領域のアミノ酸配列はアイソフォーム間であまり保存されていませんでした。 15 kDa CaAFP の 3 つのグループを比較すると、PPII ヘリックスの数は一定で、予測値は 11 であり (図 4)、各ヘリックスの長さはほぼ同等で、GXX または GGX リピートがそれぞれ 3 ～ 4 つありました。 さらに、予測されたジスルフィド結合の数は 2 から 4 まで変化しました。CaAFPb-8 (15.2 kDa) および CaAFPb-6 (15.5 kDa) の予測平均質量は、MALDI で観察されたピーク 15,158 および 15,463 Da とよく一致しました (図 2B)。

8.5 kDa CaAFP アイソフォームの配列アラインメント。 (A) EST からの CaAFP アイソフォームのアミノ酸配列と生成されたトランスクリプトームを整列させました。 同一のアミノ酸残基は灰色で強調表示されます。 グリシン残基は青色に色付けされます。 システイン残基は赤色で色付けされ、黄色で強調表示されます。 シグナルペプチドは小文字で示され、コード配列は大文字で示されている。 以下の長方形は、IBS (青) および非 IBS (赤) の面の推定 PPII ヘリックスを示しています。 CaAFPa-1、OQ445586; CaAFPa-2、GR870234; CaAFPa-3、OQ445587; CaAFPa-4、FF279148; CaAFPa-5、OQ445583; CaAFPa-6、GR869204; CaAFPa-7、FF278983。 (B) 6 つのポリプロリン II 型ヘリックス束の概略図。 逆平行ヘリックスはループ領域 (図示せず) によって接続され、2 層に配置されます。 氷と結合している表面 (青) と氷と結合していない表面 (赤) が示されています。 ヘリックス間の水素結合により折り畳みが安定します。

15 kDa CaAFP アイソフォームの配列アラインメント。 生成されたトランスクリプトームからの CaAFP アイソフォームのアミノ酸配列を、(A) 第 1 グループと (B) 第 2 グループについて整列させました。 (C) 3 番目の CaAFP アイソフォーム (CaAFPb-8) は、最初のグループ (CaAFPb-3) および 2 番目のグループ (CaAFPb-6) からの 1 つの配列にアラインメントされます。 カラーリングは図 3 と同じです。CaAFPb-1、OQ445590; CaAFPb-2、OQ445584; CaAFPb-3、OQ445585; CaAFPb-4、OQ445589; CaAFPb-5、OQ445588; CaAFPb-6、OQ445592; CaAFPb-7、OQ445593; CaAFPb-8、OQ445591。

F.カンジダ44のゲノムの注釈付きアセンブリには、他のPPIIヘリックスAFPに似たグリシン豊富な配列（OXA44825.1）（本明細書ではFcAFPと呼ぶ）をコードする単一遺伝子が含まれることが判明した。 FcAFP は GrAFP-4 と 57% の配列同一性を共有します (図 5A)。 FcAFP は、結晶学によって解析された GrAFP-4 の構造と非常によく似た構造を有すると予測され 39、9 つの PPII ヘリックスが 4 つの偶数番号のヘリックスで構成される氷結合面を形成しています。

ポリプロリン タイプ II ヘリカル バンドルの概略図。 FcAFP と CcAFP のタンパク質配列は、個々のポリプロリン ヘリックスに配置されています。 (A) FcAFP は 9 ヘリックスに配置でき、(B) CcAFP は 12 ヘリックスに配置できます。色分けは図 3 と同じです。

タンデム質量分析法によって分析されたトリプシン断片（表 1）は、調べた他の種とは異なり、F. カンジダが AFP アイソフォームを 1 つだけ持つという主張を裏付けています。 主要なスペクトルは、予測された 3 つのトリプシン断片と一致し、それらはその長さの大部分にわたって複数回配列されました。 ゲノム 44 とこのサンプル (補足表 1) は同じ単為生殖実験室株に由来するため、この正確な一致は予想外ではありませんでした。 異なる質量の同様のフラグメントは、トリプシンフラグメントのソース内フラグメンテーション 45 または翻訳後修飾を介して生じました。 フラグメントは予想よりも 16 Da 重い場合があり、追加の質量はプロリン残基とそれに続くグリシン残基と一致していました (表 1、太字)。

遺伝子配列およびトリプシン断片配列は、MALDI-MS によって観察された質量と一致しました。 主なピークは 9646 m/z で、二重荷電種は 4832 m/z でしたが、スペクトルを詳しく調べると (図 2E、挿入図)、約 16 Da 異なる 4 つのピークが明らかになりました。 最も軽いものは 9632 m/z で、修飾なしの成熟タンパク質で予測される平均質量 9630 Da とほぼ一致しますが、9464、9663、および 9679 のものはそれぞれ 1、2、または 3 つの修飾プロリンを含む可能性があります。 16 Da の質量増加は、プロリンの水酸化と一致します。 コラーゲンには X1-X2-G リピートが含まれており、その構造はコラーゲン三重らせんを形成する 3 本の PPII らせんが平行して構成されています 46。 プロリンは、全体を通して XPG モチーフ内でヒドロキシプロリンに修飾されます 47。 したがって、2 つのタンパク質の配列反復と二次構造が類似していることを考慮すると、AFP 内の 6 つの XPG モチーフのうちの 1 つを平均して同じプロセスが修飾している可能性があります。

F. カンジダから抽出されたタンパク質の TH 活性は、試験した濃度でわずか 0.2 ℃ であり、他のほとんどの種よりも低かった (図 1)。 大腸菌で組換え発現させた場合、FcAFP はわずか 2.3 μM の濃度で 0.52 ± 0.01 ℃の TH に達しました。 これは、寒冷順応後であっても、この単一遺伝子から動物内で産生されるAFPのレベルが、インビトロで達成できるレベルをはるかに下回っていることを示唆している。 AFP を生成したにもかかわらず、F. カンジダを -3 °C に 15 日間曝露した場合、どの標本も生存しませんでした 32。 ただし、飢餓状態では過冷却点は -15 °C 未満になります48。 高い TH 活性を持つ節足動物は一般に複数の AFP 遺伝子を持ち、16 遺伝子コピーを持つトウヒガの蛾 49 や本明細書の他のトビムシに例証されるように、異なる AFP アイソフォームを生成します。

Enomobrya nivalis は、冬の間、体リンパ内で最大 3.5 °C の TH 活性を持つことが以前に知られていました 50。 したがって、RNA が抽出される前に、野外で収集された限られた数の動物を順応させました。 トランスクリプトームが生成され、そこから 5 つの AFP アイソフォームが同定されました (補足図 1B)。 各配列には、長さ 22 ～ 24 アミノ酸のシグナルペプチドがありました。 成熟タンパク質の予測質量は 8.9 kDa、9.6 kDa、および 11.2 kDa でした。 8.9 kDa アイソフォーム (EnAFP-2) は、29 アミノ酸の欠失を除き、11.2 kDa アイソフォーム (EnAFP-3) と 86% 同一であり、これにより 2 つのヘリックスが除去されていると考えられます。 他の配列は 64 ～ 81% の同一性を持っていました。

他のトビバナ AFP の配列を BLAST クエリとして使用すると、PPII ヘリックス AFP に似た配列が Ceratophysella Communis (VNWX01004235.1) のゲノムで見つかりました。この遺伝子には単一のイントロン 51 が含まれると予測され、その結果得られた 732 bp のオープン リーディングが得られました。このフレームは、23 アミノ酸のシグナルペプチドを持つと予測される AFP をコードしていました 52。 成熟タンパク質は長さ 220 アミノ酸であり、12 個の PPII ヘリックスを持つようにモデル化できます (図 5B)。 C.コミュニスは収集されませんでしたが、C.デンティキュラータは収集され、ホモジネートのTHは0.7℃でした（図1）。 さらに、MALDI-MS 上の最大ピークの質量は 17.5 kDa で、成熟 C. コミュニス AFP 配列で予測される 17.2 kDa と同様でした。

サンプリングされたトビムシ類のうち 10 種は Poduromorpha 由来であり、12 種は Enomobryomorpha 由来でした (図 6)。 10 匹のポデュロモルフと 8 匹の昆虫ブリオモルフすべてが AFP 活性を持っていました。 AFP 活性を欠く 4 種は昆虫科に属していましたが、E. nivalis もこの科に属しており、AFP 活性を持っていました。 他の 14 種については、他者によって TH 活性について検査されており 28、30、53、合計 11 匹のポデュロモルフのうち 11 匹と、25 匹の昆虫ブリオモルフのうち 15 匹が AFP 活性について陽性反応を示しました。 AFPを産生しなかった種のうち、2種が昆虫科で、4種がイソトミ科で再び見つかった。

不凍タンパク質を産生するトビムシの分類木。 トビ目目 (Enomobryomorpha、Poduromorpha、Symphypleona、および Neelipleona) の 4 目からの種の分類木は、NCBI 分類法に基づいて作成されました。 TH 活性のある種とない種はそれぞれ赤と青で色付けされ、テストされていないグループは黒で表示されます。 この論文で分析された種は太字で示されており、太字になっていない他のすべての種は、Gomphiocepalus hodgsoni 30 と Cryptopygus terranovus (syn. Gressittacantha terranova) 53 を除き、Zettel 28 によってテストされました。 星が付いた種はグリシンが豊富な AFP を生成しました。 赤い四角の Gomphiocepalus hodgsoni は、シスチンとヒスチジンが豊富な AFP30 であると考えられています。

グリシンが豊富な PPII らせん束は、5 つの科と 2 つの目にまたがる 8 種のトビムシの AFP フォールドであると予測されました。 Enmobryomorpha と Poduromorpha の両方に PPII ヘリックス AFP が存在することは、このタンパク質ファミリーが分岐する前に起源を持つことを示唆しています (図 7)。 トビバタキの分類学的多様化の正確な順序はまだ議論中です。 4 つの目は、使用されるデータセットに応じて、さまざまな姉妹分岐群に分類できます。 18S および 28S 配列を使用した場合、ニーリプレオナは (Symphypleona + (Enmobryomorpha + Poduromorpha)54 の基底でした。しかし、16S、28S、および cox1 配列を使用した場合、Neelipeona と Symphypleona の位置は逆転し、Symphypleona は Basal でした 55。正確な系統関係とは無関係に、 、ミトコンドリア年代測定は、4 つの注文が 4 億 3,700 万年前から 4 億 2,100 万年前の間に分岐したことを示唆しています56。この時期は、4 億 6,000 万年前から 4 億 2,000 万年前まで続いた氷河期であるアンデス - サハラ氷河期と一致します 57。さらに、現存する家族に対応する系統は、 4 億 1,400 万年前から 1 億 8,400 万年前 56、カルー氷河期が起こったのは 3 億 6,000 万年前から 2 億 5,500 万年前 58 であり、同じ時期における多様化と耐凍性の必要性により、PPII ヘリカル AFP を発現する種の放射が可能になるだろう。

トビバの系統発生と氷河期の関係。 トビムシにおける分岐のタイムラインを示す系統樹。 緑、紫、黄色の網掛けは、それぞれ目、科、属/種の分岐の推定時間を示しています。 AFP を産生する種の数は目名の下に表示されます。 赤い矢印は新生代における魚類 AFP の出現を示します。 氷山には、それぞれの氷河期の期間が表示されます。

属への多様化のタイミングにより、AFP を欠く種が生じた可能性があります。 Enomobryoidea 上科のうち、Sinella curviseta、Heteromurus nitidus、Lepidocyrtus violaceus および Orchesella 属の 3 種は不凍活性 AFP を示さなかったが、E. nivalis は不凍活性を示した（図 6）。 中国産トビムシのサンプルの分析では、アントモブリア属の 5 つの多系統クレードが、暁新世から始新世の熱極大期に 6,600 万年前から 3,400 万年前の間に多様化したと推定されています。 約5,500万年前のこの期間、地球の気温は現在より平均5～8℃高かった60。 シネラは約 6,900 万年前にある昆虫分岐群から分岐したと推定されていますが、ヘテロムルスとオルケセラは約 1 億年前に昆虫科から分岐しました 59。 Enmobryoidea 上科の AFP 欠損種の祖先は、この時期に AFP を失い、AFP 遺伝子を持たない種の放散につながった可能性がありますが、E. nivalis 系統は AFP 遺伝子を保持していました。

暁新世から始新世の熱極大期に続く新生代（約 3,000 万年前）まで AFP が発生しなかった硬骨魚類とは異なり、この現象や前回のカルー氷河期にトビバナ AFP が突然多様化した兆候はありません。 理論的には、特定の系統は間氷期に PPII AFP タイプの遺伝子を失い、新たな氷河期に対処するために代替遺伝子を進化させた可能性があります。 この理由から、南極トビムシ種 Gomphiocepalus hodgsoni30 で以前に同定された AFP の異なるアミノ酸組成に注目する価値があります。 この AFP には、PPII 型 AFP とは異なるヒスチジンとシスチンが高い割合で含まれていました (補足表 2)。 ただし、この AFP の配列はまだ特定されていません。 興味深いことに、この種は、2 つの種 (H. harveyi と C. Communis) がグリシンに富む PPII ヘリカル AFP を生産する Hypogastruridae 科のメンバーです。

PPII AFP の起源と関連性は、タンパク質の反復的な性質により遠縁種間の比較が非常に困難であるため、決定することが困難です。 相同性は、特に不凍活性のために選択されている場合には、反復配列から容易に推測することはできません。 たとえば、アラニンに富む魚の I 型 AFP は、11 アミノ酸間隔でスレオニン残基を持つものもあり、当初は相同であるように見えましたが、現在では過去 3,000 万年以内に収束して進化したことが知られています 15。 幸いなことに、ヒラメ I 型 AFP の起源は、UTR を介して追跡されました20。 トビバラン AFP の進化にも収束が役割を果たした可能性があります。 しかし、これまでに調べられた1種を除くすべての種がグリシンに富んだAFPを生成し、既知の配列は氷結したPPIIヘリックス束としてモデル化できる(図3、5)31,38ため、これはありそうもないように思われる。結合面。 対照的に、AFP が硬骨魚類や昆虫で生じた場合、さまざまな異なるタンパク質の折り畳みが AFP として使用されました 61、62、63、64、65。 さらに、PPII ヘリックスの長さはアイソフォーム間または種間で異なりません。 追加の GGX リピートが GrAFP の各ヘリックスに追加されると、TH 活性が減少しました。これは、これがヘリックスの長さを制限する選択圧である可能性があることを示唆しています 37。

トビラン AFP の UTR を分析しても、その起源に関する手がかりが得られる可能性は低いです。 ここで研究された種の多くは、硬骨魚類よりもはるかに早くに分岐しました（図7）。 これにより、それらの非コード領域が相同であると認識できない程度に分岐するのに十分な時間が与えられました。 これは、5'-UTR と 3'-UTR を単一種の転写物間で比較した場合でも明らかです。 たとえば、EnAFP の 5'-UTR と 3'-UTR は、それぞれ 65 ～ 93% と 60 ～ 84% の配列同一性を持っています。 非コード配列の同一性の欠如は、HhAFP と MaAFP31 の間、および HhAFP38 と GrAFP39 のアイソフォームの間で以前に報告されています。 これは、これらの PPII AFP の一部は、たとえ同じ種のものであっても、3,000 万年よりはるかに長い間分岐してきたことを示唆しています。

この研究の限界の 1 つは、ニーリプレオナまたはシンフィプレオナのいずれかから種をサンプリングできないことでした。 現在、これらの目のゲノムデータとトランスクリプトームデータは、昆虫目目およびポデュロ目目に比べて過小評価されていますが、9 つのゲノム配列が NCBI で公開されています。 PPII AFP は 8 種類の Symphypleona ゲノム配列と 1 種類の Neelipleona ゲノム配列には見つかりませんでしたが、PPII AFP の反復的な性質、および豊富なグリシン豊富な遺伝子 (コラーゲンなど)、イントロン、および反復配列が豊富であることに注意する必要があります。潜在的なグリシンコドンを含むため、AFP 遺伝子の同定が困難になります。 したがって、これらの AFP の同定は組織抽出に大きく依存します。 残念ながら、私たちの知る限り、シンフィプレオナとニーリプレオナの実験室での培養は難しく、これら 2 つの目の AFP に関する詳細な研究は複雑になっています。

現在の研究中に生成されたデータセットは、GenBank リポジトリ (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) でアクセッション番号 OQ511494-98 および OQ445583-93 で入手できます。

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AFP の MALDI 分析については、クイーンズ大学のタンパク質機能発見施設の David McLeod に感謝します。 Megaphorura arctica および Folsomia candida AFP の予備分析については Marie Boddington 氏、Cryptopygus antarcticus の収集については David Denlinger 氏、Isotoma riparia の収集については Matty Berg 氏に感謝します。 この研究は、PLD に対する CIHR 財団助成金 FRN 148422 および MH に対する Det Frie Forskningsråd 助成金 1026-00055B によって支援されました。 PLD はタンパク質工学のカナダ研究委員長を務めています。 資金提供者は、研究計画、データ収集/分析/解釈、レポート作成、または出版のための論文の提出には何の役割もありませんでした。

クイーンズ大学生物医学分子科学部、18 Stuart Street、キングストン、ON、K7L3N6、カナダ

コナー・L・ショール、ローリー・A・グラハム、ピーター・L・デイヴィス

オーフス大学生態科学部陸上生態学セクション、CF Møllers Allé 4、8000、オーフス C、デンマーク

マーティン・ホルムストラップ

北極研究センター、オーフス大学、Ny Munkegade 114、8000、オーフス C、デンマーク

マーティン・ホルムストラップ

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概念化、PLD、MH、LAG。 方法論、すべての著者。 調査、CLS および LAG。 リソース、PLD および MH。 書き込み - オリジナル、CLS、PLD、および LAG。 執筆—レビューと編集、すべての著者。 視覚化、CLS。 資金調達、PLDおよびMH

ピーター・L・デイヴィスへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

ショール、CL、ホルムストラップ、M.、グラハム、LA 他。 ポリプロリン II 型ヘリカル不凍液タンパク質はトビムシに広く分布しており、4 億年以上前のオルドビス紀に起源したと考えられています。 Sci Rep 13、8880 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-35983-y

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受領日: 2023 年 3 月 31 日

受理日: 2023 年 5 月 26 日

公開日: 2023 年 6 月 1 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35983-y

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